pISSN : 3058-423X eISSN: 3058-4302
Open Access, Peer-reviewed
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Yang Won Lee
http://dx.doi.org/10.17966/KJMM.2017.22.1.21 Epub 2017 March 30
Abstract
Background: Malasseiza species are dimorphic and lipophilic fungi which are part of normal mycota of the human skin, and also associated with some skin diseases. In many skin diseases such as pityriasis versicolor, Malassezia folliculitis, seborrheic dermatitis, atopic dermatitis and psoriasis, Malassezia yeasts may have a key role.
Objective: To investigate susceptibility of antifungal agent including itraconazole, fluconazole and terbinafine, we conducted in vitro susceptibility test revealing minimum inhibitory concentration of drugs for each Malassezia strains.
Methods: Malassezia restricta CBS7877, M. globosa CBS 7966, M. slooffiae KCTC 27517, M. sympodialis CBS 7222, M. pachydermatis CBS 1879 and M. furfur CBS 1878 were used in this experiment. The strains were grown in Leeming and Notman medium. MIC was determined using the method suggested by Sugita, et al. with modification. Malassezia cells were grown in each well and incubated for 2 days at 34℃, and MIC was determined by agar dilution method.
Results: Most Malasseiza strains of all Malassezia species were most sensitive to itraconazole, with MICs ranging from 0.015 to 0.06 μg/mL. MIC values of fluconazole and terbinafine against Malassezia species were higher and wider range than MIC of itraconazole.
Conclusion: Itracozanole would be the first choice drug for treatment of Malassezia associated skin diseases. Isolation of pathologic species of Malassezia from various skin diseases in Korea would be fundamental research for the target therapy, and drug susceptibility test would be helpful for proper treatment.
Keywords
Fluconazole Itraconazole Malassezia Terbinafine
서 론
Malassezia 속(genus)은 두형태곰팡이(dimorphic fungus)로 인간의 정상 피부 미생물총(skin micro- biota)의 하나이다. 대부분의 Malassezia 종(species)은 지질친화성(lipophilic)으로 C14-C16 포화지방의 합성 효소의 결여로 인해 특정 지질이 균주(strain)의 성장에 필수적인 요인이며[1], 때문에 피지분비가 많은 두피, 안면, 체간의 특징적인 분포를 나타낸다. 정상 피부에서 Malassezia 종의 집락 형성은 출생 후 빠르게 진행되며 한달 후에 정상인구의 약 30%에서 집락이 관찰되었다[2].
많은 연구에서 Malassezia가 다양한 피부질환의 원인 및 악화인자로 보고하고 있으며, 특히 어루러기(pityriasis versicolor)에서의 병인성은 잘 알려져 있다[3]. 이외에도 말라세지아 모낭염(Mala- ssezia folliculitis), 지루피부염(seborrheic dermatitis), 아토피 피부염(atopic dermatitis), 건선(psoriasis) 등의 여러 질환에서 Malassezia와의 연관성이 제시되고 있다[4]. 균사기(mycelial phase)에 각질에 대한 침투력이 증가하는데, 대부분의 Malassezia 관련 피부 병변에서 균사기의 Malassezia가 관찰되어 질환과의 연관성을 보인다. 또한 균주의 lipase 활성도 증가 및 면역작용의 이상이 아토피 피부염과 건선 등의 염증질환의 주요 병인으로 제시되고 있으며[5], 국소적인 면역반응과 숙주의 감수성이 질환의 발현에 중요한 요인이다[6]. Malassezia는 국소 피부질환 뿐만 아니라 전신질환의 원인으로 보고되고 있는데, 최근 말기암환자나 후천성면역결핍증환자 등의 면역저하환자 및 총정맥영양법(total parenteral nutrition, TPN) 적용환자의 증가로 Malassezia에 의한 균혈증, 패혈증 및 중증 전신감염증이 새로운 문제로 대두되고 있다[7].
2000년대 이후에 배양 비 의존성, polymerase chain reaction (PCR) 기반의 방법들을 이용하여 인간의 피부에서 인종 및 질환 특이적 Malassezia 균주를 동정하는 연구가 진행되었다. 본 연구는 한국인의 피부질환에 연관성이 알려진 Malassezia 균주에서 항진균제에 대한 최소억제농도(minimum inhibitory concentration, MIC)를 통한 약물 감수성을 확인하여 항진균제의 효율적인 사용 근거를 마련하기 위해 진행되었다.
연구대상 및 방법
1. 대상 검체 및 배양조건
본 연구에서는 6종의 Malassezia 효모균의 표준 균주(type strains)를 대상으로 하였다. M. restricta (CBS 7877), M. globosa (CBS 7966), M. sympodialis (CBS 7222), M. pachydermatis (CBS 1879), M. furfur (CBS 1878) 5종은 Centraalbureau voor Schimmel- cultures (CBS, Utrechet, The Netherlands)에서, M. slooffiae (KCTC 27517) 1종은 한국생명공학연구원 생물자원 센터로부터 분양받았다. 그리고 본 실험에 이용할 6종의 Malassezia 표준 균주는 Leeming and Notman agar (LNA) 배지에 접종한 후 34℃의 환경에서 2일간 배양하였다[8].
2. 약제 희석
항진균제는 이트라코나졸(itraconazole)과 플루코나졸(fluconazole) 및 터비나핀(terbinafine)을 사용하였다. 980 μL 액체 상태의 LNA 용액을 이용하여 각각 0.0019에서 0.48 μg/mL, 0.5에서 256 μg/ mL, 0.063에서 64 μg/mL의 농도로 2배씩 희석하였다.
3. MIC의 측정
약물의 MIC를 이용한 시험관내 감수성 시험(in vitro susceptibility test)은 Sugita 등[9]이 제시한 방법을 기초로 진행하였다. MIC의 측정은 실험 균주가 자라지 않은 최소 농도로 설정하였다. The Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) reference document M27-A3를 기반으로 하였으며, 지질 친화 균주인 Malassezia의 특성에 따른 수정된 방법을 따랐다[10]. MIC 결과값은 각각 독립된 3회의 실험을 통해 얻었다.
결 과
각 균주에 대한 이트라코나졸, 플루코나졸, 터비나핀의 MIC를 측정하였다. 각각 독립적으로 시행된 실험의 결과값은 표에 나열하였다(Table 1).
이트라코나졸은 6개의 균주에서 MIC가 0.015~ 0.06 μg/mL로 상대적으로 좁은 범위의 값을 나타냈다. 가장 낮은 MIC 값을 보이는 균주는 M. restricta와 M. globosa였으며, 상대적으로 높은 MIC 값을 나타낸 균주는 M. pachydermatis와 M. furfur였다.
플루코나졸은 대상 균주에서 MIC가 4~32 μg/ mL의 범위로 측정되었다. M. sympodialis 균주의 MIC 값이 4 μg/mL로 가장 낮았고, M. globosa, M. pachydermatis에서 32 μg/mL로 가장 높았다.
터비나핀은 0.5~32 μg/mL로 가장 넓은 범위의 MIC 값을 보였다. M. restricta에서 0.5 μg/mL로 가장 낮은 MIC 결과를 얻었고, M. furfur에서는 32 μg/mL로 가장 높은 값을 나타냈다.
고 찰
Malassezia 효모균은 건강한 성인의 75~98%에서 발견되는 정상 피부균총의 우세 균주로 신체부위 특이적 분포를 나타내며 인종, 나이, 성별, 지리분포 등의 요인에 의해 다양한 차이를 나타낸다. 동양인의 경우 정상인에서 두피와 이마부는 M. restricta가 우세 균주며, 가슴과 상지부위는 M. globosa와 M.dermatitis가 우세하게 동정되나, 서양인을 대상으로 한 연구에서는 M. sympodialis가 우세하게 나타났다[11],[12],[13]. 또한 십대와 젊은 성인에서 M. restricta가 우세 균주인데 비해, 50세 이상에서는 M. globosa가 우세 균주로 관찰되었다[12].
Malassezia는 다양한 피부질환에서 균주의 종류 및 집락의 분포에 차이를 보인다. 한국에서도 많은 연구자들에 의해 질환 특이적인 균주의 동정이 진행되고 있다. 한국인의 정상 피부 미생물총에서 rDNA PCR-RFLP[14]와 pyrosequencing[15]을 통한 분자생물학적 동정으로 Malassezia 균주를 얻었고, 아토피 피부염[16], 지루피부염[17], 여드름[18] 등의 질환에서 질환 특이적 Malassezia 균주의 분포를 확인하였다. 연구에 따르면, 어루러기, 말라세지아 모낭염, 지루피부염, 건선의 경우 M. globosa가 주로 관찰되나, 아토피 피부염에서는 M. sympodialis가 우세 균주로 알려져 있다[4].
또한 한국인 환자에서 발생한 피부질환과 질환 특이적 균종에 대한 연관성을 파악하기 위한 노력도 활발하게 진행되고 있다. 한 예로, 한국인과 중국인의 지루피부염 병변에서 M. globosa, M. restricta를 동정하였고[19], 균주에 따른 중성지방합성과 IL-8 농도를 비교하여 M. globosa와 M. restricta에서 높은 지방합성과 IL-8 혈중농도를 확인했다[12]. 다른 연구에서는 M. globosa가 높은 lipase 활성도와 hyphal growth를 보여 상기 균주의 각질에 대한 침투성이 높음을 보고하고 있다[20],[21]. 반면에 아토피 피부염환자에서는 피부장벽의 손상 및 지질이상, 국소적 면역이상에 의해 다른 우세 균종의 집락이 형성될 수 있다고 보고된 바 있고[22],[23], 어루러기 환자에서 피부 상태를 측정하여 Malassezia 균종의 집락 형성과 질환의 관계를 확인하였다[24].
이트라코나졸은 트리아졸계의 항진균제로 진균 세포막의 형성에 필요한 에르고스테롤 합성을 저해하여 정진균작용(fungistatic)을 나타내며, MIC 이상의 농도에서 살진균작용(fungicidal)을 나타내기도 한다[25]. 이트라코나졸은 특히 효모균 및 비피부사상균에 대해 높은 항진균작용을 보인다. 플루코나졸은 합성 트리아졸 계열의 항진균제로 주로 정진균작용을 나타낸다. 터비나핀은 allylamine 계열의 항진균제로 스쿠알렌에 축적되어 살진균작용을 하고, 에르고스테롤 합성저해를 통해 정진균작용을 하여[26], 주로 피부사상균에 대해 강한 효과를 가진다. 이러한 항진균제는 장기별 분포와 효과 농도 등이 다양하기 때문에, 질환 및 균종에 따라 적절하게 선택해야 한다. 특히 Malassezia는 정상 피부에서 뿐 아니라, 질환에서도 인종, 성별, 연령 등의 요인에 따라 다른 우세 균주를 보인다. 그러나 아직까지 국가별 Malassezia 피부질환에 대한 비교와 적절한 항진균제의 사용에 대한 합의는 이루어지지 않은 실정이다.
본 연구에서는 저자의 기존의 연구[12],[15],[16],[17],[18],[19],[27]에서 한국인의 피부질환과 연관성이 제시된 M. restricta, M. globosa, M. slooffiae, M. sympodialis, M. pachy- dermatis, M. furfur 균주에서 항진균제인 이트라코나졸, 플루코나졸, 터비나핀의 MIC를 통한 약제 감수성을 확인하였다. 모든 균주에서 이트라코나졸에 대해 가장 높은 감수성을 나타냈으며, 이러한 결과는 다른 연구에서 진행된 감수성 실험 결과와 일치하였다[7],[28],[29]. 특히 M. restricta, M. globosa 균주에서 가장 낮은 MIC (0.015 μg/mL)를 나타냈으며 상대적으로 M. pachydermatis, M. furfur에서 높은 MIC가 관찰되었는데, 이러한 결과 역시 기존의 결과와 동일한 양상을 나타냈다[7]. 플루코나졸과 터비나핀은 이트라코나졸이 비해 높은 MIC 값을 나타냈으며 측정값의 범위도 각 균주에서 큰 차이를 나타냈다. 본연구에서 플루코나졸은 최소 MIC가 4 μg/mL로 기존의 연구보다 높게 나타났으나 각 균주에 대해 비슷한 경향성을 나타냈으며[10], 터비나핀도 기존의 연구 결과와 비슷한 결과를 나타냈다[7],[30]. Gupta 등의 연구에서 이트라코나졸은 0.03에서 0.125 μg/mL의 MIC 값을 나타냈고, 터비나핀은 0.03에서 64 μg/mL으로 관찰되었다. 대부분의 균종에서 이트라코나졸과 케토코나졸에서 높은 감수성을 보인 반면, 터비나핀은 M. obtusa, M. globosa 이외의 균종에서 낮은 감수성을 나타냈다7. Sugita 등의 연구에서는 이트라코나졸이 0.016에서 0.25 μg/mL으로 가장 높은 감수성을 나타냈다[9].
대부분의 Malassezia 연관성 피부질환(어루러기, 말라세지아 모낭염, 지루피부염, 건선)에서 우세 균종으로 관찰된 M. restricta, M. globosa에 대한 약제 감수성은 이트라코나졸에서 가장 높게 나타났다. 다른 Malassezia의 균주에 대해서도 가장 낮은 MIC를 보이므로 Malassezia에 의한 대부분의 피부질환에 가장 우선 고려해야 하는 약제이다. 실제 임상적으로 경구용 이트라코나졸은 Mala- ssezia 연관 피부염의 좋은 치료제이며, 케토코나졸(ketoconazole)은 국소도포제로 널리 쓰이고 있다[31],[32]. 터비나핀은 M. restricta와 M. sympodialis에서 비교적 높은 감수성을 보이나, 대부분의 균주의 경우 낮은 감수성을 보이므로 이트라코나졸을 사용할 수 없는 환자의 경우, 특히 경구 혈당강하제를 복용하는 환자에 대한 2차 치료제로 고려되어야 한다[33]. 플루코나졸은 모든 균주에 대해 높은 MIC 값을 나타내었다. 이는 플루코나졸이 일반적인 효모균의 치료에 가장 널리 쓰이는 약제임을 감안할 때 주목해야 하는 결과이다. 이러한 약물 감수성 결과를 토대로 임상적인 효과에 대한 검증이 필요하다. 그 이유는 도포제와 경구제 등의 투약방법의 차이로 장기별 분포 농도의 차이가 발생하기 때문이다. 실례로 어루러기 환자에서 국소도포제의 사용은 표피의 Malasseiza에 대해 좋은 효과를 가지나 진피, 땀샘, 피부부속기의 약물 농도가 경구약에 미치지 못해 치료효과가 떨어지게 된다[34].
본 연구는 몇 가지 제한점을 갖는다. 첫째, 연구대상이 특정 단일 균주에 한정되어 대상 종에 대한 대표성을 갖기 어렵다. 때문에 Malassezia 종의 다양한 균주를 대상으로 하는 추가적인 실험이 필요하다. 둘째, 각 균주의 배양과 MIC의 측정에서 단일조건을 사용하였다. Malassezia의 약물 감수성에 대한 기존 연구에서 Malassezia 종 간의 지질친화도의 차이와 균주 간의 성장 속도가 다름이 보고되었고, 배지의 종류와 배양시간에 따라 MIC의 결과에 차이가 있음을 보고하였다[7],[10]. Gupta 등의 연구에서 Diagnostic Sensitivity Testing media, LNA media, Sabouraud agar media에 각각 배양하여 비교하였으며, LNA 배지에서 가장 우수한 배양 결과를 보였다. 또한, 각 균종별로 최소 배양시간을 확인하여 M. restricta, M. globosa가 다른 균종보다 오랜 배양시간이 필요함을 확인하였다[7]. 이러한 제한점을 보완하기 위해 본 연구는 기존에 시행된 Malassezia의 MIC를 측정한 논문들을 분석하여 측정방법에 따른 결과를 분석하여 비교하였고, 전반적으로 일치하는 경향을 보였다[7],[9],[28],[29],[30].
본 연구는 MIC의 측정을 통한 Malassezia 균종에 대한 항진균제의 약제 감수성을 확인하였다. 한국인에서 발생한 Malassezia 피부질환의 치료는 일차적으로 이트라코나졸이 고려되어야 한다. 그러나 당뇨환자의 경구 혈당강하제의 사용 등을 고려하여 터비나핀이나 플루코나졸을 이차적으로 고려해야 할 것이다. 또한 본 연구에서 진행한 한국인 질환 특이적인 균종에 대한 치료약제의 약제 감수성 실험은 질환 특이적 치료뿐 아니라, 난치성 Malassezia 피부질환의 치료에도 도움이 될 것으로 기대한다.
Acknowledgements
이 논문은 건국대학교 KU학술연구비 지원에 의한 논문임.
Conflict of interest
In relation to this article, I declare that there is no conflict of interest.
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